Нижегородская Государственная Медицинская Академия

НИЖЕГОРОДСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

ОТЧЕТ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СУППОЗИТОРИЕВ РЕКТАЛЬНЫХ Биопрост®
Нижний Новгород 2001
РЕФЕРАТ

Объем отчета - 32 страницы, таблиц - 18, рисунков - 5

Ключевые слова: Биопрост®, противовоспалительное, анальгезирующее, противомикробное действие

В рамках экспериментальных исследований по доклиническому изучению специфического фармакологического действиях суппозиториев Биопрост® выполнены исследования противовоспалительного, анальгезирующего и противомикробного действия препарата в соответствии с требованиями руководящих нормативных документов.

Проведенные исследования позволили установить характер фармакологического действия и оценить степень эффективности Биопрост® при лечении экспериментального хронического простатита с учетом рекомендуемой дозы и сроков применения препарата.

Доказано наличие выраженного противовоспалительного действия суппозиториев на моделях острого и хронического воспаления при однократном применении Биопрост® .

На модели химического раздражения установлено анальгетическое действие препарата Биопрост® .
Исследование противомикробной активности в условиях in vitro и in vivo показало наличие бактериостатического эффекта в отношении малых доз Грам-положительных кокков.

Эффективность применения ректального способа поступления препарата Биопрост® в рекомендуемой терапевтической дозе (суппозиторий массой 2 грамма) подтверждается патоморфологическими, клиническими и лабораторными исследованиями анализов крови и мочи экспериментальных животных.

Таким образом, в результате проведенных исследований по изучению специфического фармокологического действия ректальных суппозиториев Биопрост® выявлено противовоспалительное, анальгизирующее и противомикробное действие препарата в отношении Грам-положительных бактерий и показана безопасность его применения при лечении инфекционного хронического простатита.

ВВЕДЕНИЕ

Проблема предупреждения и лечения часто возникающих инфекций репродуктивной системы у мужчин в настоящее время является достаточно актуальной. Около 70% мужчин, как свидетельствует медицинская статистика, страдают хроническим простатитом. В связи с этим важной остается проблема поиска новых надежных и в тоже время безопасных методов лечения любого воспалительного процесса предстательной железы.

Для проведения экспериментальных доклинических испытаний представлен новый препарат Биопрост® .

Препарат предназначен для лечения хронических воспалительных заболеваний предстательной железы, в частности бактериальных (инфекционных) простатитов. Лекарственная форма препарата Биопрост® представляет собой ректальные суппозитории массой 2 г следующего состава:

• масло семян тыквы до 40 мас.% (ФС 42-3002-97);
• тимол до 10 мас.% (ФС 42-1010-75);
• остальное - липофильная суппозиторная основа - смесь витепсола марок Н-15 и W-35 в соотношении 1:1 (НД 42-9584-98).

Рекомендуемый курс лечения препаратом Биопрост® - 14 дней по 1 суппозиторию ректально.

Действующим началом суппозиториев является комбинация масла семян тыквы, которое оказывает противовоспалительное действие, устраняет боль в простате и облегчает мочеиспускание, и тимол, оказывающий бактериостатическое действие в основном на Грам-положительную кокковую флору.

В рамках доклинических токсикологических испытаний препарата показано отсутствие общетоксического, иммунотоксического, местнораздражающего и сенсибилизирующего действия.

В процессе клинических испытаний отмечена хорошая переносимость препарата, не выявлено каких-либо местных и общих побочных эффектов. Применение указанного средства позволяет повысить эффективность лечения хронического бактериального простатита.

В настоящем отчете представлены экспериментальные данные по доклиническому изучению специфического фармакологического действия препарата Биопрост® по параметрам противовоспалительного, противомикробного и анальгезирующего действия.
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проведены в соответствии со следующими нормативными документами:

• Правила доклинических исследований безопасности и эффективности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., ИИА "Ремедиум". - 2000. - С. 7-18.
• Методические указания по изучению противомикробной активности фармакологических веществ. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., ИИА "Ремедиум". - 2000. - С. 264-274.
• Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению новых нестероидных противовоспалительных препаратов // Ведомости Научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2000. - №1. - С.44-51.

В экспериментах были использованы белые беспородные мыши, половозрелые крысы-самцы линии Вистар (питомник "Столбовая" РАМН). Содержание животных соответствовало правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), утвержденным МЗ СССР 06.07.73. Кормили животных натуральными и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР от 12.-8.77. Животные прошли карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение 14 суток. Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве определяющего показателя.

Порядок идентификации особей: маркировка животных по группам производилась с помощью красителей (эозин и метиленовый синий) соответственно имеющимся рекомендациям (Буреш, 1991).

Способ умерщвления животных: декапитация. Эксперименты проводились в летнее время года. Статистические группы в опытах состояли из 10 животных.

Методика ректального применения препарата. Препарат для исследований был представлен разработчиком в лекарственной форме - в виде ректальных суппозиториев массой 2 г. Введение препарата крысам в форме суппозиториев не представляется возможным, поэтому перед ректальным введением препарат разогревали на водяной бане в стеклянном стаканчике при температуре 38-39оС, набирали в шприц объемом 1 мл. После чего через иглу с оливой вводили животным в прямую кишку на глубину 1,5 - 2 см.

Для частичного опорожнения желудочно-кишечного тракта животных лишали корма за 4-5 часов до введения препарата. Фиксация животных руками перед манипуляцией вызывала у них рефлекторный акт дефекации, тем самым освобождая полость прямой кишки. После этого введение препарата не вызывало его эвакуации с фекальными массами, обеспечивая полное поступление в организм в указанных ниже дозах.

В качестве контрольного вещества в экспериментах использовано стерильное медицинское вазелиновое масло.

Выбор доз препарата для исследования. Исходя из рекомендуемой фирмой-заявителем схемы лечения, эквитерапевтическая доза препарата для животных в экспериментах по изучению противомикробного и противовоспалительного действия составила 28 мг/кг массы тела (расчет произведен исходя из дозировки на человека массой тела 70 кг). Для изучения анальгезирующего действия использовалась доза 1 г/кг.

При оценке специфического фармакологического действия использовались адекватные методы исследования, применяемые в фармакологии и токсикологии экспериментальных животных, отражающие функциональное состояние основных органов и систем и позволяющие судить о состоянии организма в целом.

Специфическое фармакологическое действие препарата изучено при определении противовоспалительного и аналгезирующего действия препарата Биопрост® , а также при исследовании противомикробной активности in vitro и in vivo.

Оценка противовоспалительного эффекта проводилась на модели острого воспаления лапы у крыс через 3 часа после индукции воспаления формалином. Критерием эффективности (при альтернативной оценке реакции) по данному тесту считали достоверное уменьшение отека лапы не меньше, чем на 30% по сравнению с контролем.

Изучение специфического противовоспалительного действия включало дополнительное исследование хронического пролиферативного воспаления ("фетровая гранулема" у крыс). Исследуемые вещества вводили ежедневно, в течение 7 дней. Противовоспалительное действие (влияние на пролиферативный и экссудативный компоненты хронического воспаления) выражали в процентах по отношению к контролю.

Анальгетический эффект оценивали по способности уменьшать число болевых реакций - "корчей", у мышей при внутрибрюшинном введении 0,75% раствора уксусной кислоты. Критерием эффективности (при альтернативной оценке) считали достоверное угнетение болевой реакции на 50% и более.

Изучение бактерицидной и бактериостатической активности in vitro осуществляли методом серийных разведений (Поляк., 2000.; Медицинская микробиология, 1999; Энциклопедия клинических лабораторных тестов: под ред. Н., 1997; Лабораторные методы исследования в клинике, 1987; Дмитриева,. Семенов, 1965).

Исследование противомикробной активности in vivo проводилось на модели локального хронического инфекционного простатита с определением числа микробов (КОЕ) на мл гомогената ткани предстательной железы у леченных и нелеченных животных.
Конкретные условия проведения экспериментов и отдельных тестов приведены в соответствующих разделах "РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ"

Интегральными показателями интоксикации служили: выживаемость; прирост массы тела; потребление пищи; общее поведение животных.

Функциональное состояние нервной системы оценивалось по поведенческим реакциям ("открытое поле") (МР №2166-80; Я. Буреш, О. Бурешова, Д. Хьюстон, 1991).

Состояние сердечно-сосудистой системы оценивали по изменению частоты сердечных сокращений (электрокардиограф ЭК1К-01) (Зефиров Т.Л., Светова Н.В., 1997).

Гематологические исследования включали определение гемоглобина, количества эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов, скорость оседания эритроцитов, лейкограмму (Лабораторные методы исследования в клинике, 1987; Грибова И.А., 1979).

Биохимические исследования сыворотки крови включали изучение активности аспартаттрансаминазы, аланинтрансаминазы; содержания мочевины, креатинина, белка, билирубина, холестерина.
Для определения интегральной оценки состояния иммунитета (Зенков, Куликов, 1985) использовали метод люминол-зависимой цеолит-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) фагоцитирующих клеток. Регистрировался интегральный показатель S - светосумма ХЛ за определенный промежуток времени. Считается, что эта величина пропорциональна бактерицидной и фагоцитарной активности клеток (Владимиров и др., 1996). Уровень Т- и В-лимфоцитов крови оценивали в реакциях Е- и ЕАС-розеткообразования. Для крыс в реакции спонтанного розеткообразования использовали эритроциты морской свинки. Реакции проводили при 6°С в течение 18 часов. Образовавшиеся розетки фиксировали 0,06 % глутаровым альдегидом. Розеткообразующие клетки (Е-РОК или Т лимфоциты и ЕАС-РОК или В-лимфоциты) просчитывали в мазках, фиксированных 96° этанолом и окрашенных азур-эозином. Комплемент в сыворотках крови крыс выявляли в тест-системе с гемолитической сывороткой. Реакцию оценивали визуально, за титр комплемента принимали последнее разведение сыворотки, вызывающее полный гемолиз эритроцитов.

Исследования мочи включали: определение спонтанного диуреза; анализ осадка мочи, рН, белка, глюкозы, кетонов, гемоглобина (Краевский В.А., 1976).

Патоморфологические исследования: макроскопическое описание (Западнюк И.П. с соавт, 1962; Гамбарян П.П., 1955; Жеденов В.Н., 1958) и гистологические исследования сердца, почек, легких, печени, селезенки, слизистой прямой кишки, предстательной железы, семенников (Меркулов Г.А., 1969).

Методы статистической обработки данных. Полученные результаты были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica 6.0. Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием критерия t-Стъюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Изучение противовоспалительного действия препарата Биопрост® .

Нарушение микроциркуляции и формирование отека относятся к основным признакам воспаления как возникшей в ходе эволюции реакции живой ткани на местное воспаление. В формировании острой воспалительной реакции принимают участие многочисленные медиаторы и модуляторы воспаления, образование и стадийное выделение которых отражает не только характер и интенсивность повреждающего фактора, но и длительность его воздействия. Изменение соотношения биогенных веществ способствует переходу острого воспаления в хроническую фазу с преобладанием пролиферативного компонента тканевой реакции. В этой связи при оценке противовоспалительного действия целесообразным является исследование действия препарата Биопрост® как на моделях острого экссудативного, так и хронического пролиферативного воспаления.
Влияние на острое экссудативное воспаление оценивалось при моделировании отек лапы у крыс (Winter C. et al, 1962). Острую воспалительную реакцию (отек) воспроизводили субплантарным (под подошвенный или плантарный апоневроз) введением 0,1 мл 2% раствора формалина. Выраженность воспалительной реакции оценивали через 3 часа после индукции воспаления по изменению объема лапы (онкометрически). Исследуемые вещества вводили внутрижелудочно и ректально в количестве одной терапевтической дозы (28 мг/кг) за 1 час до инъекции формалина. Противовоспалительный эффект, оцениваемый по уменьшению отека, выражали в процентах к контролю.
Проведенные исследования показали (табл. 1), что препарат обладает достаточно выраженным противовоспалительным эффектом (достоверное уменьшение отека лапы, более чем на 30% по сравнению с контролем).

Хроническое пролиферативное воспаление вызывали имплантацией под кожу живота 4-х простерилизованных фетровых дисков массой около 10мг. Операцию выполняли под нембуталовым наркозом (доза 10 мг/кг). На 8-ые сутки после операции фетровые диски с образовавшейся вокруг них грануляционными тканями извлекали.

Таблица 1

Действие Биопрост® на выраженность отека лапы крысы при развитии острого экссудативного воспаления (M±m)

№	Серия	Выраженность отека		Критерий эффективности противовоспалительного действия (%)
		мм	%
1.	Контроль	4±0,12	100
2.	Биопрост® ректально	1,7±0,1*	42,5	57,5
3.	Биопрост® внутрижелудочно	1,5±0,2*	37,5	62,5

Примечание: * - достоверность различий с контролем,р<0,05

Пролиферативную реакцию оценивали по разнице между массой высушенной гранулемы и исходной массой фетрового диска. Экссудативную реакцию оценивали по разнице между массой сырой и высушенной гранулемы.

Противовоспалительное действие (влияние на пролиферативный и экссудативный компоненты хронического воспаления) выражали в процентах по отношению к контролю.

Исследуемый препарат вводили ежедневно, в течение 7 дней в дозе 28 мг/кг ректально. Результаты исследования показали (табл. 2 и табл. 3.), что при изучении хронического пролиферативного воспаления у крыс эффективность противовоспалительного действия колеблется в пределах от 18 до 30%.

Таблица 2

Изменение массы дисков при развитии хронического пролиферативного воспаления у крыс (фетровая гранулема) (M±m)

Серия	Исходная масса дисков, г	Масса сырых дисков, г	Масса высушенных дисков, г
Контроль	0,010	0,074 ± 0,006	0,021 ± 0,001
Биопрост®	0,010	0,056 ± 0,005*	0,019 ± 0,001

Примечание: * - достоверность различий с контролем,р<0,05